La película comienza con el prólogo que abre con una nueva piloto, Mari Illustrious Makinami, que toma el control de la unidad Provisional 05 y trata de detener al Tercer Ángel, que está escapando de la Base de Betania de NERV, situada en el Ártico. El Ángel, después de haber sido encontrado en el permafrost, fue capturado y confinado en el sistema de contención de Cocito (uno de los más seguros del mundo, según se comenta en la película), pero logró escapar, y cuando se dirige a los alrededores de la zona Aqueron, circundante a la base, el EVA 05 lo ataca. Después de recibir muchos daños, Mari autodestruye la unidad y acaba con el Ángel, siendo eyectada en el Entry Plug y destruida gran parte de la base de Betania.
De vuelta en Japón, Shinji y Gendo visitan la tumba de Yui. Luego, Kaji llega al despacho de Gendo confirmando la interrupción del proyecto Marduk que se realizaba en Betania y le entrega una maleta que contiene la "Llave de Nabucodonosor", la llave para abrir la puerta de la Complementación Humana (tal vez el embrión de Adán). Entonces el Séptimo Ángel ataca la ciudad, pero es derrotado por la recién llegada Unidad 02 desde Alemania, pilotada por la fiera pelirroja Shikinami Asuka Langley.
Mientas tanto, Gendo y Fuyutsuki visitan la Base de Tabgha en la luna para ver el progreso de SEELE en la construcción de la Unidad 06 o Mark 06, y si bien el acceso a la base no les es permitido, verifican que el método de construcción de la Unidad es diferente al de NERV. Kaworu Nagisa, en el dedo del EVA, saluda a Gendo. Ya en la Tierra, Shinji se ve obligado a aprender a convivir con Asuka, que se muda a casa de Misato, y a su vez Asuka demuestra tener duras relaciones con todo el mundo, y algunos signos de amor/odio (de forma similar a la serie) con Shinji. Un día Kaji les lleva a un acuario, donde residen las últimas criaturas marinas con vida. Luego, se demuestra que Rei es vegetariana, cuando se niega a comer carne, pero descubre que la comida sin carne cocinada por Shinji le resulta deliciosa. El Octavo Ángel Sahaquiel ataca desde el espacio. Los satélites lanzan minas N2 pero no surte efecto debido al fuerte campo AT del Ángel, por lo que, después de un largo combate, las unidades 00, 01 y 02 lo destruyen, actuando en equipo como nunca antes lo habían hecho.
Al día siguiente, es el turno de Shinji para cocinar el almuerzo para la gente de su casa, y hace también para Rei, dándosela en la escuela, lo que irrita a Asuka. Este gesto abre las emociones de ella, que le pide a Gendo en la cena si podría invitar a sus amigos la siguiente semana (la cual nunca llega a realizarse). Más adelante, Mari aterriza en paracaídas en Tokyo-3, pero cae accidentalmente sobre un atónito Shinji mientras estaba en la terraza de la escuela. Después ella reconoce su identidad como piloto de EVA por el olor a líquido LCL.
Poco después es destruida en EE.UU la primera rama de NERV por la explosión del EVA 04 debido a la experimentación de nueva tecnología. NERV clausura la Unidad 02 por el Tratado del Vaticano, que limita el número de EVAs en servicio que un país puede tener; debido a que la jurisdicción de la Unidad 02 todavía estaba en manos de la Unión Europea, es Asuka la que pilota la Unidad 03. Sin embargo, el día de la activación de la unidad se descubre que estaba poseída por el Ángel Bardiel, que escapa en el EVA, todavía con Asuka en su interior. El EVA 01 es enviado a detenerlo, pero Bardiel despliega dos brazos que estrangulan a Shinji, que se niega a pelear para no herir a Asuka. Ante ello, Gendo activa el Dummy Plug y destroza al EVA 03, triturando con los dientes de la 01 el Entry Plug, aparentemente muriendo Asuka. Shinji enloquece ante ello y ataca el Geo-front, pero es detenido por el aumento de la presión del LCL en su cápsula. Al despertar, decide dejar NERV. Luego se anuncia que Asuka está viva, pero gravemente herida e infectada en parte por el Ángel.
Tras marchar Shinji, Zeruel el Décimo Ángel, traspasando la línea de defensa de Old Odawara ataca destruyendo las 24 capas protectoras del Geo-front. Mientras, la Unión Europea decide enviar a Mari a pelear con el Ángel secuestrando la Unidad 02 del almacén. Mari, al ver que no surten efecto sus ataques, quita los limitadores y activa el Modo Bestia (BEAST MODE) de la 02, un modo artificial de inducir al EVA al modo berserker, pero aun así resulta derrotada. Rei, a bordo de la Unidad 00, ataca al Ángel con un misil N2, tratando de insertarlo en el núcleo del Ángel, pero fracasa por la alta resistencia del campo AT, que le frena en su intento de penetrarlo. Entonces Mari rompe el campo AT del Ángel y Rei consigue detonar dentro de él la bomba, pero sin efecto, debido a una membrana blindada desplegada por al Ángel Zeruel sobre su núcleo. La Unidad 00 agota la energía y queda inmóvil, y la 02 cae sobre el lugar donde se hallaba Shinji. Mari le dice a Shinji que escape, y él, al ver que el Ángel devoró y asimiló a la Unidad 00 y a Rei, decide regresar a NERV. Furioso, le pide a Gendo que lo deje pilotar. Momentos después el Ángel destruye la última defensa y penetra el Dogma central, pero es atacado por la Unidad 01. Ésta se queda sin energía y Shinji activa el modo berserker inconscientemente consiguiendo de alguna forma un poder similar al de un Ángel.
Con sus nuevos poderes derrota a Zeruel, y forzando sus límites intenta rescatar a Rei. Accediendo a su núcleo, eventualmente la encuentra desnuda y agazapada en la oscuridad. Ella le dice que está conectada espiritualmente con el Ángel, con lo que decide morir para destruirlo, pero Shinji la detiene, prometiendo rescatarla. Shinji se sincroniza completamente con la Unidad 01 y saca a Rei y el núcleo del Ángel, que adoptan la forma de Rei en gran escala; entonces Ritsuko anuncia que ha llegado el Tercer Impacto, la creación de una nueva forma de vida más allá de la comprensión humana, siendo su precio cada una de las formas de vida antigua.
Después de los créditos de la película, una lanza cae del cielo y atraviesa al EVA 01/Ángel/Rei, interrumpiendo el Tercer Impacto. Kaworu, autor del lanzamiento de la lanza a bordo de la Unidad 06, desciende del cielo y anuncia: "El momento prometido ha llegado. Shinji, esta
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